直擴/直接PCR——Direct PCR，一種不需要額外提取DNA就能夠實現(xiàn)體外DNA擴增的技術，省去提取基因組DNA的繁瑣程序，可以直接應用于PCR的快速檢測。直擴PCR最早應用的領域是動植物領域，比如鼠、貓、雞、兔、羊、牛等動物的血液、組織和毛發(fā)；植物的葉片和種子等，用來研究基因分型、轉基因、質粒檢測、基因敲除分析、DNA來源鑒定、物種鑒定、SNP分析等領域。

這些領域有一些共同的特點，那就是目標基因的含量比較高，核酸提取麻煩，所以直擴PCR不僅能夠節(jié)省時間，對結果的影響很小，同時也能節(jié)省成本。本文就一起來了解一下直擴PCR技術的使用場景及常見問題。

在做分子實驗時，什么情況下建議使用直擴PCR而不是常規(guī)PCR呢？

1.只需要提取樣品基因組DNA進行PCR、分子克隆等實驗，不需要長期保存DNA。如基因型鑒定、CRISPR-Cas9陽性鑒定等；

2.樣品量較大時，做PCR鑒定需要保存陽性樣本基因組DNA，也可使用Direct PCR進行樣本初步篩選，有利于節(jié)約時間、成本；

3.樣本量較少，無法使用基因組提取試劑盒提取的樣品也可嘗試此方法。

直擴PCR常見問題與解決辦法

Q1：擴增無目的條帶？

A1：

1） 樣品

a．裂解樣品過多。建議按照說明書取樣進行裂解；

b．樣品中抑制成分濃度過高。釋樣品后再取適量作為模板。

2） 引物

a．引物設計不合理；

b．引物降解；

建議用提取的DNA樣品作為對照，用試劑盒陽性引物對照進行試驗，重新設計引物。

3）  程序：

a．PCR擴增程序不合適。調整PCR程序（優(yōu)化退火溫度：使用降落PCR，梯度PCR，增加循環(huán)數(shù)至35~40個循環(huán)、延伸時間增加等）。

Q2：擴增出現(xiàn)非特異條帶？

A2：

1） 引物：

a．引物設計不合理。重新設計引物（從引物5’端延長引物至25~30bp，Tm值65~67℃）；

b．引物濃度過高。降低引物濃度。

2）樣品

a．裂解樣品過多。建議按照說明書取樣進行裂解；

b．樣品中抑制成分濃度過高。釋樣品后再取適量作為模板。

3）  程序：

a．退火。優(yōu)化退火溫度，使用降落PCR，梯度PCR；

b．延伸。減少延伸時間；

c．循環(huán)數(shù)。降低循環(huán)數(shù)。

本期內容：直擴PCR技術的使用場景及常見問題

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