ELISA素來(lái)以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。而它作為經(jīng)典的免疫檢測(cè)方法，雖然看似平常但是要真正將該實(shí)驗(yàn)做好并不容易，酶標(biāo)板的讀值總是會(huì)不盡如人意，可見實(shí)操中的各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)該實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大，如不注意，就會(huì)產(chǎn)生一些糟心的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。跟小源一起來(lái)總結(jié)一下ELISA空白背景高的常見原因和處理方法吧!

常見原因有以下這些：

1）洗板不干凈

解決方法：

①充分洗滌：如果洗板的時(shí)間不夠，會(huì)導(dǎo)致抗體殘留，陰性對(duì)照會(huì)顯色，嘗試延長(zhǎng)洗板時(shí)間，增加洗板頻率，在洗液中添加表面活性劑Tween-20。

在洗板時(shí)要保證每步都洗滌完，充分拍板直至孔內(nèi)沒(méi)有明顯的殘留液體。

②避免交叉污染：棄去洗液和孵育的抗體時(shí)避免交叉污染，移液槍頭盡可能一次性使用，拍板的濾紙不要反復(fù)使用。

2）顯色液變質(zhì)或者試劑過(guò)期

解決方法：檢查試劑盒有效期，或使用新的試劑盒并按照說(shuō)明書要求保存試劑盒。每次用剩下的顯色液最好不要回收，或者只回收洗凈的容器裝的顯色液。

3）試劑稀釋有誤，檢測(cè)抗體/酶結(jié)合物工作液濃度過(guò)高

解決方法：按照說(shuō)明書推薦的稀釋倍數(shù)稀釋抗體。

4）試劑盒組分未平衡

解決方法：試劑盒每個(gè)組分都需要平衡至室溫后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

5）混用其他試劑盒試劑

解決方法：保證使用試劑盒內(nèi)完整的一套試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現(xiàn)象，不同批號(hào)的試劑不要混用。

6）蒸餾水受酶等污染

解決方法：使用新鮮蒸餾水。

7）培養(yǎng)箱溫度超過(guò)37℃或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

解決方法：孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，從而造成本底增高。檢查恒溫箱，確保孵育溫度穩(wěn)定在37℃，按照說(shuō)明書的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行孵育。

8）酶標(biāo)板底部有污漬

解決方法：在加完終止液之后，檢測(cè)之前，用75%乙醇浸潤(rùn)的脫脂棉球擦拭酶標(biāo)板底部，確認(rèn)沒(méi)有污漬之后再檢測(cè)。

9）洗液被污染

解決方法：洗液現(xiàn)配現(xiàn)用，長(zhǎng)期放置會(huì)析出，也可能會(huì)污染，導(dǎo)致背景偏高。

10）包被的抗原被污染

解決辦法：仔細(xì)回想操作過(guò)程，換新的抗原包被。

11）封閉液、封閉時(shí)間、封閉液的濃度

解決辦法：封閉液（BSA）可能會(huì)與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。封閉液的濃度偏低、封閉時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致封閉不che底，抗體與酶標(biāo)板結(jié)合，可能也會(huì)導(dǎo)致背景偏高，因此可以適當(dāng)調(diào)整封閉液的濃度和時(shí)間以降低背景。

12）抗體質(zhì)量差或選擇的抗體不合適

解決辦法：抗體質(zhì)量不高，特異性不好可能會(huì)與封閉液（BSA）產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可以用0.8%明膠（明膠不含有血清成分）代替。

若選擇多克隆抗體孵育，可能會(huì)與酶標(biāo)單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致背景增加，最好選用與酶標(biāo)單抗同種屬的多克隆抗體。

13）酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)有誤

解決辦法：檢查酶標(biāo)儀設(shè)置的波長(zhǎng)，不同波長(zhǎng)下樣品的吸光光度值也會(huì)有很大的差別，按照說(shuō)明書要求設(shè)置參數(shù)。

本期內(nèi)容：ELISA空白背景高的常見原因和處理方法

下期內(nèi)容：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA實(shí)驗(yàn)類型有哪些？